木耳（Auricularia）分子鉴定方法
木耳（Auricularia）分子鉴定方法
一、概述
木耳属（Auricularia）真菌的分子鉴定主要基于 核糖体 DNA（rDNA） 的多区域联合分析。rDNA 在基因组中以串联重复单元形式存在，木耳基因组中约有 310 个 重复单元（毛木耳 A. cornea），每个重复单元全长约 10.6~11.2 kb。
rDNA 重复单元结构：
|
二、核心基因/区域
1. ITS 区（Internal Transcribed Spacer）— 首选 DNA 条形码
引物： 真菌通用引物 ITS1 / ITS4
| 引物 | 序列 (5'→3') |
|---|---|
| ITS1 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG |
| ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
产物大小：约 420 bp
ITS 区包含 ITS1-5.8S-ITS2 三个子区域。对木耳属而言：
- 有效条形码长度约 420 bp
- 扩增与测序成功率 100%
- 种内差异 0.5%~2.5%，种间差异 4.8%~10.8%
- 信息位点比例可达 52.1%（黑木耳）
- 能够有效区分木耳属下不同物种
[!quote] 参考来源
White et al., 1990; 《木耳属菌株ITS序列作为DNA条形码的可行性》
2. IGS 区（Intergenic Spacer）— 种内/品种鉴定
IGS 区位于 28S 与 18S 之间，被 5S rDNA 分隔为 IGS1 和 IGS2 两个亚区。
IGS1
| 特性 | 数据 |
|---|---|
| 毛木耳（A. cornea）长度 | 2,247 bp |
| 黑木耳（A. heimuer） | 较为保守，菌株间无明显多态性 |
| 保守区间 | 1,400~2,200 bp 区域高度保守（用于品种鉴别） |
引物对（通用）：
| 引物 | 序列 (5'→3') | 位置 |
|---|---|---|
| LR12R | GAACGCCTCTAAGTCAGAATCC | 28S 3'端 |
| 5SRNA | ATCAGACGGGATGCGGT | 5S rRNA 反向互补 |
产物大小：约 2,247 bp（毛木耳）
IGS2
| 特性 | 数据 |
|---|---|
| 毛木耳（A. cornea）长度 | 2,135 bp |
| 黑木耳（A. heimuer） | 进化较快，菌株间多态性丰富 |
| 用途 | 可用于 IGS-RFLP 分析鉴别菌株 |
引物对（通用）：
| 引物 | 序列 (5'→3') |
|---|---|
| 5SRNAR | ACQGCATCCCGTCTGAT |
| invSR1R | ACTGGCAGAATCAACCAGGTA |
产物大小：约 2,135 bp（毛木耳）
[!quote] 参考来源
Vilgalys lab, Duke University; Li, Zhong & Bian, 2014
3. 完整 IGS 区（IGS1 + 5S + IGS2）
| 引物对 | 产物大小 |
|---|---|
| LR12R + invSR1R | ~4,503 bp（毛木耳） |
[!tip] 扩增建议
较小的片段（如 IGS2 3'端约 800 bp）更容易扩增和测序，适合多样性筛选。
三、各区域产物大小汇总
| 区域 | 毛木耳 A. cornea | 黑木耳 A. heimuer | 引物对 |
|---|---|---|---|
| ITS | ~420 bp | ~420 bp | ITS1 / ITS4 |
| IGS1 | ~2,247 bp | 保守（长度接近） | LR12R / 5SRNA |
| IGS2 | ~2,135 bp | 多态性丰富 | 5SRNAR / invSR1R |
| 完整 IGS | ~4,503 bp | — | LR12R / invSR1R |
| rDNA 重复单元总长 | ~10,641 bp | ~11,210 bp | — |
四、推荐的鉴定策略
物种水平鉴定
- 首选 ITS 扩增测序（~420 bp，简便可靠）
- BLAST 比对 + 系统发育树构建（MEGA, IQ-TREE）
- 必要时补充 IGS1 片段（~800 bp 内部片段）提高分辨率
品种/菌株水平鉴定
- 扩增 IGS2 区域
- 进行 RFLP 分析（推荐限制性内切酶：HpaⅡ、BstUⅠ、HinpⅠ）
- 三种酶组合可有效鉴别不同菌株
相关笔记
- [[羊肚菌（Morchella）分类学与系统发育]]
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- [[多基因联合系统发育树构建方法]]
五、参考文献
- White TJ, Bruns T, Lee S, et al. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.
- Li L, Zhong CH, Bian YB (2014). The molecular diversity analysis of Auricularia auricula-judae in China by nuclear ribosomal DNA intergenic spacer. Electronic Journal of Biotechnology, 17(1).
- 毛木耳rDNA序列结构及IGS鉴别菌种初探 (2019). 菌物学报, 38(12): 2214-2220.
- 野生黑木耳 Auricularia heimuer rDNA IGS多样性分析 (2022). 食用菌学报.
- 木耳属菌株ITS序列作为DNA条形码的可行性. 黑龙江农业科学.