真菌分子系统学与多基因系统发育树构建

以羊肚菌属（Morchella）和硫磺菌属（Laetiporus）的现代分类学研究为实例，覆盖从隐存种概念、GCPSR物种识别框架、引物设计、遗传距离、到多基因联合建树全流程的完整知识体系。

第一部分：真菌分类学基础概念

1.1 隐存种复合体（Cryptic Species Complex）

许多传统上被认为是"一个世界广布种"的真菌，经分子系统学研究后被发现实际是一群形态几乎无法区分但遗传上显著分化的独立物种。

关键启示：仅靠形态学已不足以区分现代真菌物种，分子系统发育证据是不可或缺的核心标准。

1.2 羊肚菌的 Mel/Mes 编号系统

2012 年，Taşkın 等人建立了羊肚菌属的系统发育种编号体系，通过多基因谱系一致性系统发育物种识别法（GCPSR）分析土耳其羊肚菌时正式提出。

[!note] 编号系统的意义
大多数系统发育种在发现时尚未获得正式拉丁学名，编号提供了稳定的交叉引用标识。即使后来获得正式命名（如 Mel-6 = M. sextelata），编号仍广泛使用。

1.3 硫磺菌属的分类学修订历程

第二部分：物种识别与判定框架

2.1 GCPSR —— 谱系一致性物种识别法

GCPSR（Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition）由 Taylor et al. (2000) 提出，是当前真菌新种判定的核心理论框架。

基本原理

物种边界应由多个独立基因系谱之间的系统发育不一致性转折点来确定。

• 同一物种内存在基因重组（有性生殖 → 基因流动）→ 不同基因树的拓扑不一致
• 两个物种之间存在生殖隔离 → 多个独立基因位点的系统发育信号将一致地将其分为独立支系
• 由一致性到不一致性的过渡，即为物种界限

操作化定义

2.2 新种判定的多相分类学框架

现代真菌新种描述采用多相分类学（Polyphasic Taxonomy）方法，将三类证据结合：

          ┌──────────────────────┐
          │   候选新种假说        │
          └──────────┬───────────┘
                     │
     ┌───────────────┼───────────────┐
     ▼               ▼               ▼
分子系统发育      形态学证据       生态学证据
┌─────────┐    ┌─────────┐    ┌─────────┐
│多基因树  │    │宏观特征  │    │寄主/基质 │
│单基因树  │    │微观特征  │    │地理分布  │
│遗传距离  │    │孢子大小  │    │季节/海拔 │
│GCPSR    │    │培养特征  │    │火适应性  │
└────┬────┘    └────┬────┘    └────┬────┘
     │               │               │
     └───────────────┼───────────────┘
                     ▼
            ┌─────────────────┐
            │ 一致支持新种?    │
            └────────┬────────┘
                     ▼
            MycoBank 注册
            指定模式标本
            同行评审发表

2.3 新种判定的四道关卡

第一关：谱系独立性与一致性

第二关：遗传分化程度

与最近缘已知种的遗传距离需达到种间水平（见第四部分遗传距离详解）。

第三关：形态/生态/地理的区分性

对于硫磺菌属，寄主类型（针叶树 vs 阔叶树）是区分近缘种的关键特征。对于羊肚菌属，地理分布和出菇季节是重要辅助证据。

第四关：物种注册与发表

1. 在 MycoBank 或 Index Fungorum 注册
2. 指定模式标本（Holotype）并保藏于公认标本馆
3. 提供完整的拉丁描述或英文描述
4. 在同行评审期刊发表

第三部分：分子标记与引物设计

3.1 为什么需要多基因？

在硫磺菌论文中，6 个基因合并后 3,963 bp，含 525 个简约信息位点；ITS 单独仅约 80 个信息位点，信息量差距约 6.5 倍。

3.2 硫磺菌研究中六基因详细信息

基因位点总览

引物序列表

[!important] RPB2 引物为自主设计
通用真菌 RPB2 引物 fRPB2-5F / fRPB2-7cR 在硫磺菌属中扩增效果不佳（弱带或非特异性扩增）。Song & Cui（2017, 2018）针对硫磺菌属专门设计新引物 6F-1 / 7R-1，覆盖 RPB2 基因保守结构域 6 至结构域 7 之间约 700–800 bp 区域。

PCR 扩增条件

各基因退火温度优化：50°C（ITS, mtSSU, nrLSU）、52°C（RPB2）、54°C（EF-1α, nrSSU）。

PCR 扩增片段 vs 建树用序列

[!warning] 关键区别
PCR 扩增的原始片段 不等于 用于建树的序列。经 MAFFT 比对和手动修剪后，去除引物结合区、两端保守区、非明确同源区后，长度会显著缩短。

论文中 3,963 bp 是经 MAFFT G-INS-I 比对和手动修剪后的合并矩阵总长度，去除了所有非明确同源位点。

各基因详细说明

ITS（内转录间隔区）
ITS5 结合在 18S rDNA 3' 端，ITS4 结合在 28S rDNA 5' 端，扩增完整 ITS1–5.8S–ITS2 区域。是真菌通用条形码，初步鉴定时最先测序的位点。论文建树时去除了两端保守区。

nrLSU（核糖体大亚基 28S rDNA）
LR0R 对应酿酒酵母 LSU 第 26–42 位，LR7 对应第 1449–1433 位，覆盖 D1–D3 结构域。因扩增片段最长（~1.4 kb），需 60 s 退火 + 90 s 延伸。进化速率慢，贡献属级及以上信号。

nrSSU（核糖体小亚基 18S rDNA）
PNS1/NS41 扩增约 60% 的 18S rDNA 编码区。进化速率最慢，主要贡献科/目级深层系统发育信号，稳定树的基本拓扑。

mtSSU（线粒体小亚基 rDNA）
MS1/MS2 扩增线粒体小亚基 rRNA 基因中间区域。线粒体基因进化速率与核基因不同，提供独立于核基因组的系统发育信号。

EF-1α（翻译延伸因子 1-α）
EF1-983F/EF1-1567R 的编号（983/1567）为氨基酸位置。扩增区域在硫磺菌中含少量小内含子。蛋白编码基因第 3 位密码子进化快，贡献种间分辨率。

RPB2（RNA聚合酶II第二大亚基）
6F-1/7R-1 覆盖保守结构域 6 至 7。作为单拷贝核基因，是 GCPSR 框架中最重要的蛋白编码标记之一。该研究中 88% 的 RPB2 序列为新测。

第四部分：遗传距离与物种界限

4.1 遗传距离是什么？

遗传距离（genetic distance）是衡量两条 DNA 序列差异程度的数值指标。

p-distance = 差异碱基数 / 总比对碱基数 × 100%

示例: 两条各 500 bp 的 ITS 序列，比对后 15 个碱基不同
     p-distance = 15/500 × 100% = 3.0%

4.2 种内变异 vs 种间分化 —— Barcode Gap

核心逻辑：同一物种内个体间变异通常远小于不同物种之间的差异。

种内变异(intraspecific):  个体A ↔ 个体B    0.0–1.0%   ← 窄
                            ↓↓↓ barcode gap ↓↓↓
种间分化(interspecific):  物种X ↔ 物种Y    2.0–10.0%   ← 宽

当 barcode gap 清晰存在时 → 可用单基因（ITS）区分物种
当 barcode gap 缺失或模糊时 → 必须依赖多基因 + GCPSR

4.3 真菌中不存在万能阈值

[!warning] 核心结论
传统上常用 ITS 相似度 97–99%（即 1–3% 遗传距离）作为物种界限的经验阈值，但这一阈值在不同真菌类群中差异极大，不存在普适标准。

Barcode gap 的关键影响因素：

1. 类群差异：不同属的分子进化速率截然不同
2. 分类策略："细分派"（splitting）产生更窄的种内变异和更大的 gap；"合并派"（lumping）则相反
3. ITS 区域选择：ITS1 变异速率约为 ITS2 的 2 倍；ITS2 的 barcode gap 比 ITS1 更稳定
4. 杂交和不完全谱系分选：可显著模糊物种边界

4.4 硫磺菌属中的具体应用

在 Song et al. (2018) 中，"遗传距离达到种间水平"体现在三个层次：

层次一：ITS 序列固定差异

候选新种与最近缘种的 ITS 序列存在多个固定差异位点（非个体内多态性），其 p-distance 超过硫磺菌属已知种内变异的上限（通常 <1%）。

层次二：6 个基因一致独立分支

L. medogensis vs. L. ailaoshanensis：
  ITS:    独立分支，BS ≥ 95%
  nrLSU:  独立分支，BS ≥ 90%
  nrSSU:  独立分支，BS ≥ 85%
  mtSSU:  独立分支，BS ≥ 88%
  EF-1α:  独立分支，BS ≥ 95%
  RPB2:   独立分支，BS ≥ 92%
→ 6个独立基因一致支持 → 满足GCPSR

层次三：分支长度反映分化时间

在 ML/BI 树上，候选新种形成长分支（long branch），表明自与姐妹群分化以来积累了足够多的固定替换。

4.5 判别流程

1. 测候选标本的 6 个基因
2. 与 GenBank 中所有已知近缘物种序列比对
3. 计算与每个已知种的遗传距离（p-distance / K2P）
4. 如果:
   (a) 与最近缘种的遗传距离 > 该属已知种内变异上限
   (b) 在 ≥2 个基因的单基因树上形成独立高支持分支
   (c) 存在可量化的形态/生态/地理区分特征
   → 满足新种标准

[!note] 优先级
遗传距离是辅助参考，GCPSR 谱系一致性才是首要标准。"多棵树说同一句话"比"一个数字超过阈值"更可靠。

第五部分：多基因联合系统发育树构建

5.1 测序策略与并行工作流

基因组DNA提取（CTAB法，从子实体或菌丝体）
    ↓
6对引物独立PCR扩增（每标本 × 6个反应 = 330个PCR反应）
    ↓
琼脂糖凝胶电泳验证（单一明亮条带）
    ↓
Sanger双向测序（每条片段正反向2个反应 = 660个测序反应）
    ↓
SeqMan Pro / Geneious Prime 拼接 + 切除低质量末端
    ↓
NCBI BLAST 验证身份 + 排除污染

该研究共提交了 226 条新序列至 GenBank。其中 nrSSU 100% 新测，EF-1α 和 RPB2 分别有 85% 和 88% 新测。

5.2 完整十步流程

graph TD
    A["步骤1: 序列整理<br/>每基因一个FASTA文件"] --> B["步骤2: MAFFT比对<br/>每基因独立, G-INS-I"]
    B --> C["步骤3: 比对修剪<br/>trimAl + 手动"]
    C --> D["步骤4: 串联合并<br/>FASconCAT → 超级矩阵"]
    D --> E["步骤5: PHT检验<br/>PAUP* 1000次"]
    E --> F{"P > 0.05?"}
    F -- "否" --> F1["ASTRAL溯祖法<br/>或移除冲突基因"]
    F -- "是" --> G["步骤6: 模型选择<br/>MrModeltest/ModelFinder"]
    G --> H["步骤7: 三种方法建树<br/>ML + BI + MP"]
    H --> I["步骤8: 单基因树检查<br/>确认无严重冲突"]
    I --> J["步骤9: 树可视化<br/>FigTree/iTOL/ggtree"]
    J --> K["步骤10: 数据提交<br/>GenBank + TreeBase"]

5.3 各步详细操作

步骤1：序列整理

# 按基因分别整理，每个FASTA含自己的序列 + GenBank参考序列
ITS_raw.fasta       # 55条
nrLSU_raw.fasta     # 55条
nrSSU_raw.fasta     # 55条
mtSSU_raw.fasta     # 55条
EF1a_raw.fasta      # 55条
RPB2_raw.fasta      # 55条

序列命名：>属名_种名_菌株号，如 >Laetiporus_medogensis_Cui12240

步骤2：MAFFT 比对

for gene in ITS nrLSU nrSSU mtSSU EF1a RPB2; do
    mafft --thread 8 --maxiterate 1000 --globalpair \
          raw_${gene}.fasta > ${gene}_aligned.fasta
done

比对后用 BioEdit 或 AliView 手动检查，排除大片段插入和无法明确对齐的区域。

步骤3：trimAl 修剪

for gene in ITS nrLSU nrSSU mtSSU EF1a RPB2; do
    trimal -in ${gene}_aligned.fasta \
           -out ${gene}_trimmed.fasta \
           -gt 0.5 -fasta
done

手动修剪要点：蛋白编码基因的内含子区必须切除；ITS 两端 18S/28S 保守区去除。

步骤4：FASconCAT-G 串联

perl FASconCAT-G_v1.06.pl -s -o concatenated *_trimmed.fasta

输出：concatenated.fas + concatenated.phy + concatenated_partition.txt

分区文件格式：

#NEXUS
BEGIN SETS;
    charset ITS = 1-612;
    charset nrLSU = 613-1524;
    charset nrSSU = 1525-2780;
    charset mtSSU = 2781-3412;
    charset EF1a = 3413-3963;
    charset RPB2 = 3964-4832;
END;

步骤5：PHT 检验 —— 最关键的质控

原理：检验各基因分区之间是否存在显著拓扑冲突。P > 0.05 表示可以合并。

PAUP* 脚本：

BEGIN PAUP;
    execute concatenated.nex;
    hompart partition=genes nreps=1000;
END;

论文结果：P = 0.19（> 0.05），确认六基因合并。

如果 P < 0.05：排查冲突来源 → 除去冲突基因后重测 → 严重时改用 ASTRAL 溯祖法。

步骤6：模型选择

论文方法：MrModeltest v2.3 + AIC，结果所有分区均为 GTR + I + G。

现代方法（推荐）：

iqtree -s concatenated.phy -p partitions.txt -m MFP+MERGE -T 20

步骤7：三种方法建树

最大似然法（ML）—— RAxML（论文在 CIPRES 超算平台运行）：

raxmlHPC-HYBRID -s concatenated.phy -q partitions.txt \
    -m GTRGAMMA -N 100 -f a -# 1000 -n Laetiporus_ML

现代替代 IQ-TREE（推荐）：

iqtree -s concatenated.phy -p partitions.txt \
    -m MFP+MERGE -B 1000 --alrt 1000 -bnni -T 20 --safe -pre Laetiporus

贝叶斯推断（BI）—— MrBayes：

BEGIN MRBAYES;
    charset ITS = 1-612; ...;
    partition genes = 6: ITS, nrLSU, nrSSU, mtSSU, EF1a, RPB2;
    set partition = genes;
    unlink statefreq=(all) revmat=(all) shape=(all) pinvar=(all);
    prset applyto=(all) ratepr=variable;
    lset applyto=(all) nst=6 rates=invgamma;
    mcmc ngen=5000000 nruns=2 nchains=4 samplefreq=1000
         printfreq=1000 diagnfreq=1000 burninfrac=0.25;
    sumt burninfrac=0.25;
END;

最大简约法（MP）—— PAUP*：

论文结果：68 棵同等简约树（TL=1173, CI=0.812, RI=0.865）。

支持值阈值：

步骤8：单基因树冲突检查

for gene in ITS nrLSU nrSSU mtSSU EF1a RPB2; do
    iqtree -s ${gene}_trimmed.fasta -m MFP -B 1000 -T 8 -pre ${gene}_single
done

步骤9-10：可视化与数据提交

• FigTree / iTOL / ggtree 可视化
• GenBank 提交序列
• TreeBase 提交比对矩阵

5.4 完整命令行流水线

#!/bin/bash
# 真菌多基因系统发育全流程
THREADS=20
GENES=(ITS nrLSU nrSSU mtSSU EF1a RPB2)

# 1. 比对
for g in "${GENES[@]}"; do
    mafft --thread $THREADS --maxiterate 1000 --globalpair \
          raw_${g}.fasta > ${g}_aligned.fasta
done

# 2. 修剪
for g in "${GENES[@]}"; do
    trimal -in ${g}_aligned.fasta -out ${g}_trimmed.fasta -gt 0.5 -fasta
done

# 3. 串联
perl FASconCAT-G_v1.06.pl -s -o concat *_trimmed.fasta

# 4. PHT 检验（需在 PAUP* 中运行）

# 5. IQ-TREE（模型选择+ML建树一步完成）
iqtree -s concat.phy -p concat_partition.txt \
       -m MFP+MERGE -B 1000 --alrt 1000 -bnni \
       -T $THREADS --safe -pre my_project

# 6. 贝叶斯（可选）
# mpirun -np $THREADS mb mrbayes.nex

echo "输出文件："
echo "  my_project.contree    ← ML 共识树 + bootstrap"
echo "  my_project.best_scheme ← 最优分区方案"
echo "  my_project.iqtree      ← 完整报告"

5.5 软件版本速查

5.6 最容易出错的环节

[!danger] 六大常见错误

1. PHT 检验被忽略 —— 不检验或 P<0.05 仍强行串联
2. 内含子未切除 —— 蛋白编码基因比对中混入非同源内含子
3. 外类群选择不当 —— 与本类群亲缘过远（比对困难）或过近（无法正确定根）
4. 贝叶斯未收敛 —— ESS < 200 不应采用结果
5. 单基因树冲突被忽视 —— 任何基因显著反对合并树都应处理
6. PCR片段与建树序列混淆 —— PCR 扩增的原始长度 ≠ 建树用的比对长度

第六部分：中国代表性研究实例

6.1 羊肚菌属

• 全球：80+ 系统发育种，三大支系
• 中国：约半数系统发育种有分布
• 主要栽培种：六妹羊肚菌（M. sextelata, Mel-6）、梯棱羊肚菌（M. importuna, Mel-10）
• 详见 [[羊肚菌（Morchella）分类学与系统发育]]

6.2 硫磺菌属

• 全球：17–21 个系统发育种
• 中国已发表：4 个新种（哀牢山、环纹、墨脱、新疆硫磺菌）
• 研究团队：北京林业大学戴玉成/崔宝凯团队
• 发表时间线：2014 → L. ailaoshanensis, L. zonatus（Mycologia）；2017 → 全属系统发育与生物地理（BMC Evol. Biol.）；2018 → L. medogensis, L. xinjiangensis（MycoKeys）
• 详见 [[硫磺菌（Laetiporus）分类学与新种鉴定]]

6.3 研究基因数演进

相关笔记

• [[羊肚菌（Morchella）分类学与系统发育]]
• [[硫磺菌（Laetiporus）分类学与新种鉴定]]
• [[硫磺菌新种发表完整工作流程]]
• [[木耳（Auricularia）分子鉴定方法]]

参考文献

1. Song J, Sun Y, Ji X, Dai Y, Cui B. (2018) Phylogeny and taxonomy of Laetiporus with descriptions of two new species from western China. MycoKeys, 37: 57–71. PMID: 30116139

2. Song J, Cui B. (2017) Phylogeny, divergence time and historical biogeography of Laetiporus. BMC Evolutionary Biology, 17: 102. PMID: 28424048

3. Song J, Chen Y, Cui B, et al. (2014) Morphological and molecular evidence for two new species of Laetiporus from southwestern China. Mycologia, 106(5): 1039–1050. PMID: 24987130

4. Taşkın H, et al. (2012) A multigene molecular phylogenetic assessment of true morels (Morchella) in Turkey. Fungal Genetics and Biology, 47(8): 672–682.

5. Taylor JW, et al. (2000) Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi. Fungal Genetics and Biology, 31: 21–32.

6. Katoh K, Standley DM. (2013) MAFFT multiple sequence alignment software version 7. Molecular Biology and Evolution, 30: 772–780.

7. Minh BQ, et al. (2020) IQ-TREE 2: New models and efficient methods for phylogenetic inference. Molecular Biology and Evolution, 37: 1530–1534.

8. Ronquist F, et al. (2012) MrBayes 3.2: Efficient Bayesian phylogenetic inference. Systematic Biology, 61: 539–542.

9. Wilson AW, et al. (2023) Does One Size Fit All? Variations in the DNA Barcode Gaps of Macrofungal Genera. Journal of Fungi, 9(8): 788.