硫磺菌（Laetiporus）新种发表——完整工作流程与数据统计指南

本文结合硫磺菌属最新分类学进展（Song et al. 2014, 2017, 2018; Hakizimana et al. 2024）与 GCPSR 物种识别框架，系统梳理发表一个硫磺菌新种所需的全部工作、数据和统计信息。

一、工作总览

发表一个硫磺菌新种，需要完成四大模块、十二个阶段的工作，从野外采集到论文发表，全程通常需要 6–18 个月。

graph LR
    A["模块一<br/>标本采集与保藏"] --> B["模块二<br/>形态学数据收集"]
    B --> C["模块三<br/>分子系统学分析"]
    C --> D["模块四<br/>新种描述与发表"]
    
    A1["1.野外采集"] --> A2["2.标本制作"] --> A3["3.菌种分离"]
    B1["4.宏观形态"] --> B2["5.微观形态"] --> B3["6.培养特征"]
    C1["7.DNA提取与PCR"] --> C2["8.测序与比对"] --> C3["9.系统发育分析"]
    D1["10.新种描述"] --> D2["11.MycoBank注册"] --> D3["12.论文发表"]

模块	主要工作	预计耗时	关键产出
标本采集与保藏	野外采集、标本制作、菌种分离纯化	2–4 周	模式标本 + 活体菌株
形态学数据	宏观拍照、显微测量、培养观察	2–3 个月	形态描述 + 测量数据表
分子系统学	DNA 提取、6 基因 PCR、建树分析	3–6 个月	系统发育树 + GenBank 序列
新种描述与发表	撰写描述、注册、投稿	2–4 个月	发表论文

二、模块一：标本采集与保藏

2.1 野外采集

基本信息记录（每个标本必须记录）

信息类别	具体项目	记录方式
采集编号	采集人 + 年份 + 序号（如 Cui 12240）	标签 + 记录本
采集日期	年/月/日	照片 EXIF + 记录本
采集地点	省/市/县 + 具体地名 + GPS 坐标（经纬度，精确到秒）	GPS 设备或手机定位
海拔高度	米（m a.s.l.）	GPS 或海拔表
寄主信息	树种（尽可能鉴定到种）、活立木/枯木/倒木、腐朽类型	拍照 + 采集寄主标本
生境描述	森林类型（针叶林/阔叶林/混交林）、郁闭度、土壤类型	文字记录 + 环境照片
气候信息	温带/亚热带/热带，降雨量大致情况	后期查询气象数据补充

野外照片要求

拍摄对象	要求	张数
子实体正面	自然光，含比例尺	≥ 3
子实体腹面（孔面）	展示孔口颜色、密度	≥ 2
子实体纵切面	展示菌肉厚度、颜色分层	≥ 1
着生状态	展示与寄主的位置关系	≥ 2
周围生境	展示森林类型和植被	≥ 2
新鲜状态细节	菌盖表面纹理、边缘形态	≥ 2

采集数量要求

每个候选新种至少需要 2–5 份标本（来自不同子实体个体），以评估种内变异。单份标本不足以支撑新种描述。

2.2 标本制作与保藏

步骤	方法	注意事项
干燥	40–50°C 烘干（真菌标本烘干箱），至完全干燥	温度过高损坏 DNA
编号	标签注明采集号、学名（暂定）、采集地、日期	使用防水标签
保藏	密封袋 + 干燥剂，保存于标本馆	定期检查虫蛀和霉变
模式标本	指定 Holotype，保藏于公认标本馆	如 BJFC（北京林业大学真菌标本馆）、HMAS（中国科学院微生物研究所真菌标本馆）

[!important] 标本馆要求
新种的模式标本（Holotype）必须保藏于国际认可的公共标本馆（具有 Index Herbariorum 编号）。私人收藏不能作为模式标本保藏地。

2.3 菌种分离与保藏

步骤	方法
分离方法	从新鲜子实体菌肉组织块分离（组织分离法），或单孢子分离
培养基	PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）或 MEA（麦芽提取物琼脂）
培养条件	25°C，暗培养
纯化	尖端菌丝纯化，连续转接 2–3 次至无污染
保藏	4°C 斜面保藏 + 甘油管 −80°C 超低温保藏
保藏编号	菌株号对应标本号，如 Cui 12240 → 菌株 Cui 12240

三、模块二：形态学数据收集

3.1 宏观形态特征

需测量的指标

特征	测量/描述内容	样本量要求
菌盖大小	长度 × 宽度 × 厚度（cm），记录范围 + 平均值 ± SD	n ≥ 5 个子实体
菌盖颜色	使用标准色卡（如 Munsell 或 Royal Horticultural Society 色卡）	新鲜状态记录
菌盖表面	光滑/粗糙/绒毛状，环纹有无及明显程度	描述 + 拍照
菌盖形状	半圆形/扇形/莲座状/覆瓦状	描述
孔面颜色	硫磺黄/奶油色/白色/浅黄色	新鲜 vs 干燥对比
孔口密度	每毫米孔口数（个/mm），在体视显微镜下计数	n ≥ 10 个随机视野
菌肉厚度	mm，测量新鲜子实体纵切面	n ≥ 5
菌肉颜色	新鲜/干燥/ KOH 反应	描述
子实体重量	g，新鲜状态下	n ≥ 3
气味与味道	新鲜时的特征	描述

宏观特征统计表模板

标本号	菌盖长(cm)	菌盖宽(cm)	菌盖厚(cm)	孔面颜色	孔口密度(/mm)	菌肉厚(mm)	环纹(有/无)
Cui 12240	8.5	6.2	1.8	浅黄	4	12	无
...	...	...	...	...	...	...	...
平均值±SD	X.X±X.X	X.X±X.X	X.X±X.X	—	X.X±X.X	XX±X	—

3.2 微观形态特征

需制备的切片

切片类型	染色/封片剂	目的
菌髓（trama）纵切	5% KOH + 1% 刚果红或棉蓝	观察菌丝系统类型、菌丝排列
子实层（hymenium）切片	同上	观察担子、囊状体、担孢子
菌盖表面切片	同上	观察皮层结构
孔口切片	同上	观察孔口菌丝结构

需测量的微观数据

特征	测量内容	样本量要求
担孢子大小	长 × 宽（μm），记录范围 + 平均值 ± SD	n ≥ 30 个孢子
担孢子长宽比 Q	长度/宽度，记录范围 + 平均值	基于上述数据计算
担孢子形状	椭圆形/卵形/近球形/圆柱形	描述
担孢子壁特征	壁厚、光滑/粗糙、有无油滴	描述
担子大小	长 × 宽（μm），担子孢子梗数（2/4）	n ≥ 20
菌丝系统类型	一体型/二体型/三体型	判定
生殖菌丝	直径（μm）、分隔类型（简单分隔/锁状联合）、壁厚	n ≥ 20
骨架菌丝	直径（μm）、壁厚、分枝情况	n ≥ 20
囊状体	有无、大小、形状	描述
菌盖皮层结构	菌丝排列方式、有无壳状层	描述
KOH 反应	菌丝在 5% KOH 中的颜色变化	描述

孢子测量数据统计表模板

标本号	孢子范围(μm)	平均值±SD(μm)	Q值范围	Q平均值±SD	测量数 n
标本A	5.0–6.2 × 4.2–5.2	5.6±0.3 × 4.7±0.3	1.1–1.3	1.19±0.05	30
标本B	...	...	...	...	30

[!note] 孢子测量注意事项

必须从自然弹射的孢子印或成熟子实层切片中测量，不能测量未成熟孢子

测量时以孢子在光学显微镜下的最大投影面为准

至少测量 2 份不同标本的孢子，以评估种内变异

3.3 培养特征

观察项目	方法	记录内容
菌落形态	PDA 平板，25°C 暗培养，每 2 天拍照	菌落颜色、质地、边缘形态、气生菌丝密度
生长速率	每 2 天测量菌落直径	绘制生长曲线，计算日均生长速率（mm/d）
最适温度	设置 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C 梯度	各温度下生长速率对比
色素产生	观察培养基是否变色	颜色描述
特殊气味	嗅闻菌落	描述有无特殊气味

四、模块三：分子系统学分析

4.1 DNA 提取与 PCR 扩增

六基因体系（硫磺菌属标准配置）

基因	引物对	退火温度	PCR 片段长度	建树用长度
ITS	ITS5 / ITS4	50°C	~600–700 bp	~450–550 bp
nrLSU	LR0R / LR7	50°C	~1,400 bp	~1,200–1,300 bp
nrSSU	PNS1 / NS41	54°C	~1,100 bp	~1,000 bp
mtSSU	MS1 / MS2	50°C	~700–800 bp	~600–700 bp
EF-1α	EF1-983F / EF1-1567R	54°C	~550–650 bp	~500–550 bp
RPB2	6F-1 / 7R-1（硫磺菌专用）	52°C	~700–800 bp	~650–750 bp

[!warning] RPB2 引物选择
通用真菌 RPB2 引物（fRPB2-5F / fRPB2-7cR）在硫磺菌属中扩增效果不佳。必须使用 Song et al. (2018) 为硫磺菌属自主设计的 6F-1 / 7R-1 引物对。

每标本 PCR 反应统计

项目	数量
基因数	6
每基因 PCR 反应数	1
正向测序数	6
反向测序数（双向测序）	6
每标本总反应数	18（6 PCR + 12 测序）

对于 n 个候选新种标本 + m 个参考标本，总规模约为 (m+n) × 18 个反应。

4.2 序列数据处理

处理流程与数据统计

步骤	工具	产出	需统计的数据
峰图查看	SeqMan Pro / Geneious Prime	拼接后的序列	每序列 Phred 质量值 ≥ 30 的比例
序列拼接	同上	Contig	双向测序覆盖度
BLAST 验证	NCBI BLASTn	最匹配物种	序列相似度 Top 10 结果表
污染排除	人工核查	确认无污染序列	排除的序列数及原因

需整理的序列数据集

每个基因文件夹内容：
├── ITS/
│   ├── ITS_raw.fasta          # 原始序列（含自己的 + GenBank 下载的参考序列）
│   ├── ITS_aligned.fasta      # MAFFT 比对后
│   └── ITS_trimmed.fasta      # trimAl 修剪后
├── nrLSU/（同上结构）
├── nrSSU/（同上结构）
├── mtSSU/（同上结构）
├── EF1a/（同上结构）
└── RPB2/（同上结构）
    
最终串联文件：
├── concatenated.fas            # 串联超级矩阵
├── concatenated.phy            # PHYLIP 格式
└── concatenated_partition.txt  # 分区文件

需要统计的序列数据

统计项	说明
每条序列长度	bp 数
比对后长度	经 MAFFT 比对和修剪后的长度
GC 含量	各基因的平均 GC%
变异位点数	Variable sites
简约信息位点数	Parsimony-informative sites
自裔位点数	Singleton sites
保守位点数	Constant sites
各基因序列数	每条基因包含的总序列条数（含外类群）
新提交序列数	本研究新提交至 GenBank 的序列数

合并矩阵统计表模板

基因	序列数	比对长度(bp)	变异位点	简约信息位点	GC%
ITS	55	612	180	96	48.2
nrLSU	55	1,378	280	145	52.1
nrSSU	55	1,041	95	38	51.5
mtSSU	55	682	152	78	38.9
EF-1α	55	512	201	115	53.7
RPB2	55	738	210	128	55.2
合并	55	4,963	1,118	600	—

4.3 遗传距离计算

计算项目	方法/工具	输出
种内遗传距离	MEGA / PAUP*，计算所有同种个体间的 p-distance 和 K2P	种内变异范围、均值
种间遗传距离	同上，计算候选新种与每个已知种之间的遗传距离	种间距离矩阵
ITS barcode gap 分析	对比种内最大距离 vs 种间最小距离	是否存在 barcode gap

[!important] 遗传距离判定参考
硫磺菌属 ITS 种内变异通常 < 1%。候选新种与最近缘已知种的 ITS 遗传距离需 ≥ 2–3%，且超过该属已知种内变异上限。

遗传距离统计表模板

对比对象	ITS p-distance	ITS K2P	nrLSU K2P	EF-1α K2P	RPB2 K2P
新种 vs 近缘种A	3.2%	3.3%	1.1%	4.5%	3.8%
新种 vs 近缘种B	5.1%	5.4%	1.8%	6.2%	5.1%
新种种内	0.2%	0.2%	0.1%	0.3%	0.2%

4.4 系统发育分析

三种建树方法必须全部运行

方法	软件	需要统计的指标
最大似然法 (ML)	RAxML / IQ-TREE	Bootstrap 支持率 (BT)
贝叶斯推断 (BI)	MrBayes	后验概率 (BPP)
最大简约法 (MP)	PAUP*	Bootstrap 支持率 (BT)、树长 (TL)、一致性指数 (CI)、保留指数 (RI)

ML 分析参数与统计

项目	需记录的值
分区方案	各基因的分区边界
最优进化模型	每分区的最优模型（如 GTR+I+G）
Bootstrap 重复次数	≥ 1,000
似然值 (lnL)	最优树的 lnL 值
各分支 BT 值	标注在树上

BI 分析参数与统计

项目	需记录的值	判定标准
运行代数	论文标准：500 万代	—
链数	4（1冷+3热）	—
独立运行次数	≥ 2，需收敛到相同拓扑	—
Burn-in 比例	前 25% 丢弃	—
收敛诊断	ESS 值（有效样本量）	ESS > 200
PSRF（潜在尺度缩减因子）	—	接近 1.00
各分支 BPP 值	标注在树上	≥ 0.95 为显著支持

MP 分析参数与统计

项目	需记录的值
同等简约树数	MPTs
树长 (Tree Length, TL)	—
一致性指数 (CI)	—
保留指数 (RI)	—
调整后一致性指数 (RC)	—
简约 Bootstrap 支持率	≥ 75% 为显著
启发式搜索策略	TBR 分支交换，1,000 次随机添加

PHT 检验（分区同质性检验）

项目	需记录的值
检验方法	ILD (Incongruence Length Difference) test
重复次数	1,000
P 值	P > 0.05 表示可以合并
如 P < 0.05	需排查冲突来源或改用 ASTRAL 溯祖法

4.5 GCPSR 谱系一致性判定

这是判定新种的核心标准。需要对 6 个基因分别构建单基因树，然后逐一检查。

单基因树检查表

基因	候选种是否形成独立分支？	支持率 (BS/BPP)	是否与合并树冲突？
ITS	✅ 是	96 / 1.00	否
nrLSU	✅ 是	88 / 0.98	否
nrSSU	✅ 是	82 / 0.96	否
mtSSU	✅ 是	91 / 1.00	否
EF-1α	✅ 是	97 / 1.00	否
RPB2	✅ 是	94 / 1.00	否

通过条件：≥ 2 个基因的单基因树中候选分支获得显著支持（ML/MP BS ≥ 75%，BI BPP ≥ 0.95），且没有任何基因显著反对该分支。

4.6 数据提交

提交平台	提交内容	获得标识
GenBank	所有新获得的序列	登录号（Accession number），如 MN123456–MN123500
TreeBase	比对矩阵 + 系统发育树	提交号（Submission ID）

GenBank 提交清单

基因	提交序列数	每序列信息
ITS	n	标本号、物种名（如为新种暂用 sp. nov.）、产地、采集日期
nrLSU	n	同上
nrSSU	n	同上
mtSSU	n	同上
EF-1α	n	同上
RPB2	n	同上

五、模块四：新种描述与发表

5.1 新种描述撰写

描述必须包含的要素

要素	内容要求
学名	拉丁学名，符合《国际藻类、真菌和植物命名法规》（ICNafp）
词源	Etymology，解释学名来源（如地名、寄主、特征）
模式标本	正模 Holotype 指定（标本号 + 保藏机构编号），采集地、日期、寄主
拉丁文/英文描述	完整的形态描述（宏观 + 微观）
形态照片	子实体野外照片 + 显微照片（孢子、担子、菌丝等）
系统发育树图	展示新种在属内的系统发育位置（ML/BI 树，标注支持率）
鉴别特征	Diagnosis，与最近缘种的区分要点
已知分布	目前已确认的分布区域
生态习性	寄主、基质、季节、海拔
其他标本	副模 Paratype 列表（如有）

种间对比鉴定表（Diagnosis 核心）

特征	新种 sp. nov.	近缘种 A	近缘种 B
菌盖颜色	粉黄色至浅粘土色	橙黄色至红橙色	奶油色至白色
孔口密度（/mm）	4–5	4–6	3–6
孢子大小（μm）	5.0–6.2 × 4.2–5.2	5.5–7.0 × 4.5–5.5	5.0–6.5 × 4.0–5.0
孢子 Q 值	1.1–1.3	1.2–1.4	1.1–1.3
环纹	无至微环纹	无	明显
寄主类型	裸子植物（冷杉）	被子植物（壳斗科）	被子植物（阔叶树）
分布	西藏墨脱	云南哀牢山	云南
ITS 遗传距离 vs 新种	—	4.2%	6.8%

5.2 MycoBank 注册

步骤	操作
注册平台	MycoBank 或 Index Fungorum
注册时机	论文投稿前或投稿时
注册内容	学名、命名人、模式标本信息、分类学地位
获得标识	MycoBank 编号（如 MB 8XXXXX），必须在论文中引用此编号

5.3 论文投稿

项目	建议
目标期刊	MycoKeys, Mycologia, Fungal Biology, Mycological Progress, Phytotaxa
论文结构	引言 → 材料与方法 → 结果（形态 + 系统发育）→ 分类学处理（Taxonomy）→ 讨论 → 参考文献
图表要求	系统发育树（高分辨率 TIFF/EPS）+ 形态照片图版（PLATE）
数据可用性声明	GenBank 登录号 + TreeBase 提交号 + MycoBank 号

六、完整数据检查清单

[!important] 发表新种前逐项核对
以下检查表涵盖所有必须完成的工作项和数据项，确保无一遗漏。

6.1 标本与保藏

采集 ≥ 2–5 份标本（不同个体）
GPS 坐标记录（精确到秒）
海拔记录
寄主树种鉴定（至少鉴定到属）
生境描述与照片
新鲜子实体多角度照片（≥ 10 张，含比例尺）
标本烘干制作完成
Holotype 指定并保藏于公认标本馆
Paratype 列表（如有）
菌种分离成功（≥ 1 株）
菌种保藏于公认菌种保藏中心（如 CGMCC）

6.2 形态学数据

菌盖大小测量（n ≥ 5）
菌盖颜色色卡比对
菌盖环纹/表面特征描述
孔面颜色记录
孔口密度统计（n ≥ 10 视野）
菌肉厚度测量（n ≥ 5）
担孢子测量（n ≥ 30，报告范围 + 均值 ± SD）
担孢子 Q 值计算
担子测量（n ≥ 20）
菌丝系统类型判定
生殖菌丝测量（n ≥ 20）
骨架菌丝测量（n ≥ 20）
囊状体检查
菌盖皮层结构描述
KOH 颜色反应记录
显微照片（孢子、担子、菌丝、皮层）

6.3 培养特征

菌落形态描述与拍照
生长曲线数据（至少测 14 天）
日均生长速率（mm/d）
温度梯度实验数据（至少 5 个温度梯度）
最适生长温度确定

6.4 分子数据

基因组 DNA 提取成功（纯度 A260/A280 = 1.8–2.0）
6 个基因全部 PCR 扩增成功
双向测序完成
序列拼接质量验证
BLAST 验证完成
GenBank 参考序列下载整理完成
每个基因的单基因 FASTA 文件整理
MAFFT 比对完成
trimAl 修剪完成
合并矩阵构建完成（记录总长度、各基因分区）

6.5 系统发育分析

PHT 检验通过（P > 0.05）或冲突已处理
ML 树构建完成（记录最优模型、lnL）
BI 树构建完成（记录代数、ESS、收敛状态）
MP 树构建完成（记录 TL、CI、RI）
支持值标注完整（ML BS / BI BPP / MP BS）
6 个单基因树全部构建完成
单基因树无严重冲突
遗传距离矩阵计算完成
GCPSR 判定通过

6.6 新种描述与发表

拉丁学名拟定（符合命名法规）
词源（Etymology）撰写
完整形态描述撰写（英文/拉丁文）
Diagnosis（鉴别诊断）撰写
种间对比表制作
系统发育树图制作
形态图版（PLATE）制作
MycoBank 注册完成（获取编号）
GenBank 序列提交（获取登录号）
TreeBase 数据提交
论文撰写完成
投稿至同行评审期刊

七、关键参考资料汇总

7.1 硫磺菌属分类学核心文献

文献	内容	引用场景
Song et al. (2018) MycoKeys 37: 57–71	中国西部 2 新种描述，6 基因系统发育	方法学模板、引物序列、鉴定对比
Song & Cui (2017) BMC Evol Biol 17: 102	全属系统发育、分化时间、生物地理	属级系统发育框架
Song et al. (2014) Mycologia 106: 1039–1050	云南 2 新种描述	形态描述参考
Ota et al. (2009) Mycol Res 113: 1283–1300	东亚硫磺菌属分类	东亚物种对比
Hakizimana et al. (2024) Mycologia 116: 1083–1100	非洲硫磺菌 4 种（含 2 新种）	最新分类框架
Banik et al. (2010) Mycologia 102: 911–917	北美-日本交配不亲和	生殖隔离证据
Paez et al. (2023) Mycologia 115: 107–121	L. persicinus 移出属	属界修正参考

7.2 方法学核心文献

文献	内容
Taylor et al. (2000) Fungal Genet Biol 31: 21–32	GCPSR 物种识别框架
Katoh & Standley (2013) Mol Biol Evol 30: 772–780	MAFFT 比对
Minh et al. (2020) Mol Biol Evol 37: 1530–1534	IQ-TREE 2
Ronquist et al. (2012) Syst Biol 61: 539–542	MrBayes 3.2
Wilson et al. (2023) J Fungi 9: 788	大型真菌 barcode gap 变异

八、工作流程甘特图

gantt
    title 硫磺菌新种发表工作时间线（参考）
    dateFormat  YYYY-MM
    axisFormat  %m月
    
    section 标本采集
    野外采集与标本制作     :2026-06, 2026-07
    菌种分离与纯化         :2026-07, 2026-08
    
    section 形态学
    宏观形态观察与拍照     :2026-07, 2026-08
    显微切片与测量         :2026-08, 2026-10
    
    section 分子实验
    DNA提取与PCR           :2026-08, 2026-10
    测序与序列整理         :2026-10, 2026-12
    
    section 系统发育分析
    多基因比对与建树       :2026-12, 2027-02
    GCPSR判定              :2027-02, 2027-03
    
    section 发表
    新种描述撰写           :2027-03, 2027-04
    MycoBank注册与投稿     :2027-04, 2027-05

参考文献

1. Song J, Sun Y, Ji X, Dai Y, Cui B. (2018) Phylogeny and taxonomy of Laetiporus (Basidiomycota, Polyporales) with descriptions of two new species from western China. MycoKeys, 37: 57–71. DOI: 10.3897/mycokeys.37.26016. PMID: 30116139

2. Song J, Cui B. (2017) Phylogeny, divergence time and historical biogeography of Laetiporus (Basidiomycota, Polyporales). BMC Evolutionary Biology, 17: 102. DOI: 10.1186/s12862-017-0948-5. PMID: 28424048

3. Song J, Chen Y, Cui B, et al. (2014) Morphological and molecular evidence for two new species of Laetiporus from southwestern China. Mycologia, 106(5): 1039–1050. DOI: 10.3852/13-402. PMID: 24987130

4. Ota Y, Hattori T, Banik MT, et al. (2009) The genus Laetiporus (Basidiomycota, Polyporales) in East Asia. Mycological Research, 113(11): 1283–1300. DOI: 10.1016/j.mycres.2009.08.014

5. Hakizimana JC, et al. (2024) Laetiporus in tropical Africa is represented by a single Afromontane lineage and four species. Mycologia, 116(6): 1083–1100. DOI: 10.1080/00275514.2024.2395688. PMID: 39423306

6. Banik MT, Lindner DL, Ota Y, Hattori T. (2010) Relationships among North American and Japanese Laetiporus isolates inferred from molecular phylogenetics and single-spore incompatibility reactions. Mycologia, 102(4): 911–917. DOI: 10.3852/09-183

7. Taylor JW, et al. (2000) Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi. Fungal Genetics and Biology, 31: 21–32.

8. Paez CA, et al. (2023) Revising the taxonomic placement of Laetiporus persicinus within the Laetiporaceae. Mycologia, 115(1): 107–121. DOI: 10.1080/00275514.2022.2139144. PMID: 36533930

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